扩增子(Amplicon)数据分析流程|Qiime2

Introduction

我学习微生物组分析的过程是从shot-gun 宏基因组数据分析开始的，反而没怎么做过相对更早更成熟的扩增子测序的上游分析😂，最近刚好有需求，还是自己学习并搭建一下自己用的比较舒服的流程吧。

扩增子（Amplicon）分析是研究微生物群落组成与功能的核心方法之一，特别是在生态学、医学和环境科学领域。通过对目标基因区域（如16S rRNA、18S rRNA、ITS）的特异性扩增与测序，扩增子分析能够高效揭示样本中微生物的多样性和群落结构。相比宏基因组测序，扩增子分析具有成本低、处理流程简化等优势，适用于大规模样本研究。

扩增子分析的核心原理是通过聚合酶链式反应 (PCR) 技术，对目标微生物基因片段进行特异性扩增和测序，以解析微生物群落组成及其多样性。通常选择的目标片段为具有保守区域和高变异区域的基因，如细菌的16S rRNA基因、真菌的ITS区等。保守区域用作引物设计的靶点，高变异区域用于区分不同物种。

具体步骤包括：

DNA 提取：从样本中提取总 DNA。
目标基因扩增：使用特异性引物扩增目标区域。
高通量测序：测序得到大量扩增子的序列数据。
生物信息学分析：对序列进行过滤、聚类、注释，获得物种分类和功能信息。

这种方法的优势在于其高灵敏度和特异性，可以快速揭示微生物多样性并进行定量分析。

细菌

细菌核糖体RNA (rRNA) 包括 5S rRNA (120bp)、16S rRNA (~1540bp) 和 23S rRNA (~2900bp)。

5S rRNA: 序列短，遗传信息量有限，无法用于分类鉴定。
23S rRNA: 序列过长，突变率高，不适用于远缘种类分析。
16S rRNA: 稳定性高、拷贝数多，约占细菌RNA总量的80%，基因中包含10个保守区和9个高变异区，适合细菌分类标准。V3-V4 区因特异性和数据库支持最佳，常用于多样性分析。

真核生物

真核微生物的 rRNA 包括 5.8S、18S 和 28S rRNA，其中 18S rRNA 常用于多样性分析。

18S rRNA: 基因序列包括保守区和可变区 (V1-V9, 无 V6)。可变区反映物种差异，V4 区因分类效果佳、数据库支持丰富，是分析和注释的最佳选择。

真菌

ITS (内源转录间隔区) 位于真菌 18S、5.8S 和 28S rRNA 基因之间，由 ITS1 和 ITS2 组成，分别长约 350 bp 和 400 bp。

保守性: 基因片段在种内稳定，种间差异显著，适用于细粒度分类。
灵活性: 容易分析和扩增，广泛用于真菌种属和菌株系统发育研究。

古菌

古菌生活于极端环境，是生命极限的代表。通过引物设计，16S rRNA 的 V4V5 区是古菌多样性研究的核心区域。

Illumina MiSeq: 519F/915R 适用于 V4V5 扩增。
Roche 454: 344F/915R 表现更佳。
古菌研究揭示了其独特的生物特征，促进了极端生态学和生物系统学的发展。

Qiime2

QIIME 2 (Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2) 是一个功能强大的微生物组数据分析平台，专为从原始 DNA 序列到可解释的生物学结论的全过程而设计。它是 QIIME 的升级版本，具有更高的灵活性、可扩展性和可重复性。

网站：https://qiime2.org/

详细教程：https://docs.qiime2.org/

主要特点：

模块化架构：
- QIIME 2 使用插件系统，支持不同的分析任务（如数据导入、质量控制、OTU/ASV 分类、可视化等）。
- 常用插件包括 dada2（去噪）、feature-classifier（分类）、diversity（多样性分析）。
可重复性：
- 分析工作流被记录在 .qza 和 .qzv 文件中，包含完整的元数据和参数信息。
- 易于分享和复现研究结果。
交互式可视化：
- 支持交互式的结果可视化（如多样性分析、特征分类）。
- 可在 QIIME 2 View 网站上直接查看 .qzv 文件。
广泛支持的数据类型：
- 支持多种数据输入格式，如 FASTQ、BIOM。
- 可处理单端或双端序列，以及扩增子、宏基因组、宏转录组数据。
强大的社区和生态系统：
- QIIME 2 拥有活跃的用户社区和丰富的文档支持。
- 易于与其他工具（如 R、Python、QIIME 1、PICRUSt）集成。

QIIME 2 的分析过程通常包括以下步骤：

数据导入：
- 将原始数据（如 FASTQ 文件）导入为 QIIME 2 的 .qza 格式。
质量控制与去噪：
- 使用插件如 DADA2 或 Deblur 进行序列修剪、去噪和去冗余。
特征表构建：
- 生成 ASV 表（或 OTU 表）和代表性序列。
序列分类：
- 利用分类器（如 SILVA、Greengenes、UNITE）对特征序列进行物种注释。
多样性分析：
- 计算 α 多样性（物种丰度）和 β 多样性（样本间差异），并进行统计分析。
可视化：
- 生成图形化结果，如 PCA 图、丰度热图、分类饼图等。

优点：

高度可扩展，支持多种微生物组分析。
工作流透明，方便重复分析和结果共享。
插件生态丰富，可根据需要选择不同的工具。

缺点：

学习曲线较陡，需熟悉命令行操作。
对计算资源需求较高，处理大规模数据可能较慢。

QIIME 2 是现代微生物组研究的核心工具之一，尤其适合大规模扩增子数据的处理和分析。安装的话尽量用conda直接装下整个环境，然后整个Qiime2分析平台太多太复杂了，像多样性分析，可视化等步骤都可以后续在R语言里更灵活地实现，没必要一定用Qiime2。我们明确一下我们的输入和输出目标（获得feature-table，feature的物种注释结果，feature的系统发育树基本就够了），这里只用下面最关键的几个步骤就行：

Input data

测序公司一般返回的是按照每个样本拆分好的双端fq文件，或者单端fq文件，或者已经做了简单质控和拼接后的单个fq文件（可以当作单端fq文件），我们从这里开始进行分析。

metadata.tsv的话是我们的实验设计（第一列SampleID，可以有一些实验分组的列），想搞的话可以搞一个，后续基于Qiime可视化的话可以用上，没有的话也没关系。

双端fq文件

需要先准备一个一个制表符分隔的（即 .tsv）文本文件manifest。第一列定义样本 ID，而第二列（和可选的第三列）定义正向（和可选反向）读取的绝对文件路径：

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sample-id     forward-absolute-filepath       reverse-absolute-filepath
sample-1      $PWD/some/filepath/sample1_R1.fastq.gz  $PWD/some/filepath/sample1_R2.fastq.gz
sample-2      $PWD/some/filepath/sample2_R1.fastq.gz  $PWD/some/filepath/sample2_R2.fastq.gz
sample-3      $PWD/some/filepath/sample3_R1.fastq.gz  $PWD/some/filepath/sample3_R2.fastq.gz
sample-4      $PWD/some/filepath/sample4_R1.fastq.gz  $PWD/some/filepath/sample4_R2.fastq.gz

然后数据导入qiime2，这里假设reads格式为双端33格式（PairedEndFastqManifestPhred33V2）

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qiime tools import \
  --type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' \
  --input-path manifest \
  --output-path demux.qza \
  --input-format PairedEndFastqManifestPhred33V2

单端fq文件

同样需要准备manifest文件：

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sample-id     absolute-filepath
sample-1      $PWD/some/filepath/sample1_R1.fastq
sample-2      $PWD/some/filepath/sample2_R1.fastq

然后数据导入qiime2，这里假设reads格式为单端33格式（SingleEndFastqManifestPhred33V2）

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qiime tools import \
  --type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' \
  --input-path manifest \
  --output-path demux.qza \
  --input-format SingleEndFastqManifestPhred33V2

其他类型

其他类型数据的导入方式可以参考https://docs.qiime2.org/2024.10/tutorials/importing/，主要是未拆分的fq文件，就是说所有样本都在一个fq文件里，但是不同样本具有不同的barcode可以用来区分。

这种的话需要新建一个muxed-se-barcode-in-seq文件夹，把多样本的一个fq文件和对应metadata文件放在文件夹里，metadata其中包含一列用于 FASTQ 解复用（demultiplexing）的每个样本barcode（或两列双索引条形码）

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qiime tools import \
  --type MultiplexedPairedEndBarcodeInSequence \
  --input-path muxed-pe-barcode-in-seq \
  --output-path multiplexed-seqs.qza

ASV/OTU

ASV（Amplicon Sequence Variant）和 OTU（Operational Taxonomic Unit）是微生物组研究中用于表征样本中微生物分类单元的两个核心概念。具体可以参考师姐以前写的介绍https://www.jianshu.com/p/f31581bbfb80。

1. OTU

定义：OTU 是通过对扩增子序列进行聚类后定义的分类单元。通常基于序列间的相似性（如 97% 或 99% 相似性）将序列归为同一 OTU。
特点：
- 常用聚类方法如 UCLUST、VSEARCH、USEARCH。
- 需要参考数据库或 de novo 聚类（无参考）。
- OTU 表可能存在冗余（因聚类误差导致部分不一致）。

2. ASV

定义：ASV 是通过严格的去噪算法（如 DADA2 或 Deblur）精确定义的单个核苷酸级别变异的序列单元。
特点：
- 不依赖相似性阈值，直接基于序列精确变异。
- 生成的序列表更加真实和精细，减少了因聚类导致的信息丢失。
- 去除了测序误差，保留了真实生物学变异。

特性	ASV	OTU
定义	精确的序列变异单位	相似性聚类的单位
分析方法	去噪算法（DADA2、Deblur）	聚类算法（VSEARCH、UCLUST）
分辨率	核苷酸级别	依赖设定的相似性阈值（如 97%）
误差处理	去噪模型精准去除测序误差	聚类可能保留部分测序误差
对数据质量要求	较高	较低

ASV 是现代扩增子分析的主流方法，其精确性和可比较性显著优于 OTU。OTU 在一些特定场景仍有使用价值，但逐渐被 ASV 所取代。

ASV

在 QIIME 2 中，去噪（denoising）是重要步骤，用于去除测序误差并生成高分辨率的 ASV（Amplicon Sequence Variants）。目前支持两种主流的去噪方法：DADA2 和 Deblur。DADA2 使用基于错误模型的算法，通过学习测序误差分布，精确校正序列错误并去除嵌合体；它适合于单端和双端数据，能够直接输出无错误的 ASV 表。Deblur 则是基于参考序列的去噪方法，通过对序列进行截断和归一化操作，快速去除低质量序列及噪音，适合质量已优化的单端数据。两者均能高效生成高分辨率的 ASV，但 DADA2 更注重错误校正，而 Deblur 在速度上更具优势。

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# 选择1，DADA2，不一定要trim和trunc，看自己数据，这里是单端数据，双端稍微改一下参数
qiime dada2 denoise-single \
  --i-demultiplexed-seqs demux.qza \
  --p-trim-left 0 \
  --p-trunc-len 120 \
  --o-representative-sequences rep-seqs-dada2.qza \
  --o-table table-dada2.qza \
  --o-denoising-stats stats-dada2.qza

# 改名，放入主流程
mv rep-seqs-dada2.qza rep-seqs.qza
mv table-dada2.qza table.qza

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# 选择2，deblur，不一定要trim和trunc，看自己数据，这里是单端数据，双端稍微改一下参数
qiime quality-filter q-score \
  --i-demux demux.qza \
  --o-filtered-sequences demux-filtered.qza \
  --o-filter-stats demux-filter-stats.qza
 
qiime deblur denoise-16S \
  --i-demultiplexed-seqs demux-filtered.qza \
  --p-trim-length 120 \
  --o-representative-sequences rep-seqs-deblur.qza \
  --o-table table-deblur.qza \
  --p-sample-stats \
  --o-stats deblur-stats.qza

# 改名，放入主流程
mv rep-seqs-deblur.qza rep-seqs.qza
mv table-deblur.qza table.qza

OTU

在 QIIME 2 中，序列聚类用于根据相似性对扩增子序列进行分组，生成 OTU（Operational Taxonomic Units） 表。目前支持三种主要聚类策略：De novo 聚类 完全基于样本序列间的相似性，无需参考数据库，适合研究未被充分表征的微生物群落；封闭引用聚类 仅将序列与参考数据库进行比对，未匹配的序列会被丢弃，适合标准化分析和与已有数据的比较；开放引用聚类 则结合两者优势，先对序列与参考数据库比对，再对未匹配序列进行 de novo 聚类，适合兼顾探索性研究和数据库参考分析的场景。注意，优先使用ASV吧。

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# 如果input数据是fq文件，需要先想办法质控后转化为fasta文件，
# 可以参考https://docs.qiime2.org/2019.1/tutorials/read-joining/
# 因为OTU聚类需要输入fasta文件
qiime tools import \
  --input-path seqs.fna \
  --output-path seqs.qza \
  --type 'SampleData[Sequences]'
  
# 导入数据后，第一步可以使用 dereplicate-sequences 命令去重复。
qiime vsearch dereplicate-sequences \
  --i-sequences seqs.qza \
  --o-dereplicated-table table.qza \
  --o-dereplicated-sequences rep-seqs.qza

# 选择1，De novo clustering
qiime vsearch cluster-features-de-novo \
  --i-table table.qza \
  --i-sequences rep-seqs.qza \
  --p-perc-identity 0.99 \
  --o-clustered-table table-dn-99.qza \
  --o-clustered-sequences rep-seqs-dn-99.qza

# 选择2，Closed-reference clustering
qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
  --i-table table.qza \
  --i-sequences rep-seqs.qza \
  --i-reference-sequences 85_otus.qza \
  --p-perc-identity 0.85 \
  --o-clustered-table table-cr-85.qza \
  --o-clustered-sequences rep-seqs-cr-85.qza \
  --o-unmatched-sequences unmatched-cr-85.qza

# 选择3，Open-reference clustering
qiime vsearch cluster-features-open-reference \
  --i-table table.qza \
  --i-sequences rep-seqs.qza \
  --i-reference-sequences 85_otus.qza \
  --p-perc-identity 0.85 \
  --o-clustered-table table-or-85.qza \
  --o-clustered-sequences rep-seqs-or-85.qza \
  --o-new-reference-sequences new-ref-seqs-or-85.qza

筛选处理

试了下如果这一步产生的ASV太多的话，后续建树（fasttree预估20多天）和物种注释（2天还没完）要非常久，可以稍微对table进行筛选。

例如，当过滤样本时，可以使用它来过滤总频率是样本频率分布中的异常值的样本。在许多16S调查中，某些样本只能获得很少（可能是数十）的序列，这可能是由于样本生物量较低导致DNA提取率较低。在这种情况下，用户可能希望根据样本的最小总频率（即，在此示例中为样本获得的序列总数）来删除样本。这可以通过如下方式实现（在本例中，总频率小于1500的样本将被过滤）。

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qiime feature-table filter-samples \
  --i-table table.qza \
  --p-min-frequency 1500 \
  --o-filtered-table sample-frequency-filtered-table.qza

此过滤器可以应用于特征轴以从表中删除低丰度特征。例如，您可以删除总丰度（所有样本的总和）小于 10 的所有特征，如下所示。

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qiime feature-table filter-features \
  --i-table table.qza \
  --p-min-frequency 10 \
  --o-filtered-table feature-frequency-filtered-table.qza

基于偶然性的过滤用于根据样本包含的特征数量从表中过滤样本，或者根据观察到的样本数量从表中过滤特征。

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qiime feature-table filter-features \
  --i-table table.qza \
  --p-min-samples 2 \
  --o-filtered-table sample-contingency-filtered-table.qza

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qiime feature-table filter-samples \
  --i-table table.qza \
  --p-min-features 10 \
  --o-filtered-table feature-contingency-filtered-table.qza

建树

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### 构建进化树，可以用来展示物种，也可以计算后续的基于发育距离的alpha和beta多样性
qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree \
  --i-sequences rep-seqs.qza \
  --o-alignment aligned-rep-seqs.qza \
  --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
  --o-tree unrooted-tree.qza \
  --o-rooted-tree rooted-tree.qza

然后还可以做一个简单的summary和可视化：

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qiime feature-table summarize \
  --i-table table.qza \
  --o-visualization table.qzv \
  --m-sample-metadata-file metadata.tsv
qiime feature-table tabulate-seqs \
  --i-data rep-seqs.qza \
  --o-visualization rep-seqs.qzv

这些qzv文件都可以直接拖动到https://view.qiime2.org/网站来查看可视化结果。

物种注释

数据库注释

常用的扩增子数据库上次介绍过了，涉及到16S rRNA基因的序列数据库时，有三个主要的数据库是常用的：Greengenes、SILVA 和 RDP。UNITE数据库是用于真菌鉴定和多样性检测的主要marker基因数据库。具体信息每个数据库主页都有写，我们拿来用的话关键就是两个文件，一个是数据库提供的序列fasta文件，另一个是这些序列对应的taxonomy文件。

拿一个UNITE数据库做例子（用来真菌ITS比较多的），先去官网https://unite.ut.ee/repository.php找到对应的资源下载（注意版本号等信息）。

读入数据库：

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# 导入参考序列
qiime tools import \
  --type FeatureData[Sequence] \
  --input-path sh_refs_qiime_ver9_99_s_all_25.07.2023.fasta \
  --output-path unite-ver9-seqs_99_25.07.2023.qza
# 导入物种分类信息
qiime tools import \
  --type FeatureData[Taxonomy] \
  --input-path sh_taxonomy_qiime_ver9_99_s_all_25.07.2023.txt \
  --output-path unite-ver9-taxonomy_99_25.07.2023.qza \
  --input-format HeaderlessTSVTaxonomyFormat

注释的话，在 QIIME 2 中，feature-classifier 插件提供多种方法用于扩增子序列的分类注释，帮助识别微生物物种或更高分类级别。常用方法包括：朴素贝叶斯（Naive bayes）分类器，利用预训练的参考数据库（如 Silva 或 Greengenes）对序列进行概率性分类，是最常用的分类方法；vsearch-based consensus 分类，通过与参考数据库的序列比对，基于相似性得出共识分类，适合精确匹配需求；BLAST+ 分类，使用 BLAST 算法与参考序列比对，能够提供灵活的匹配控制。此外，还支持训练自定义分类器，适用于特定研究需求。各方法在速度、灵敏度和对参考数据库的依赖上各有优劣，用户可根据数据特点和研究目标灵活选择。

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# 选择1，朴素贝叶斯分类器
# 注意，首先要有训练好的分类器qza文件才能用，可以参考下一节训练分类器
qiime feature-classifier classify-sklearn \
  --i-classifier unite-ver9-99-classifier-25.07.2023.qza \
  --i-reads rep-seqs.qza \
  --o-classification taxonomy.qza
  
# 选择2，vsearch
qiime feature-classifier classify-consensus-vsearch \
  --i-query rep-seqs.qza \
  --i-reference-reads unite-ver9-seqs_99_25.07.2023.qza \
  --i-reference-taxonomy unite-ver9-taxonomy_99_25.07.2023.qza \
  --o-classification taxonomy_vsearch.qza
  
# 选择3，blast
qiime feature-classifier classify-consensus-blast \
  --i-query rep-seqs.qza \
  --i-reference-reads unite-ver9-seqs_99_25.07.2023.qza \
  --i-reference-taxonomy unite-ver9-taxonomy_99_25.07.2023.qza \
  --o-classification taxonomy_blast.qza

简单画个物种堆积柱形图，后续导出数据再R里画也行。上面几种方法的物种注释结果有差异，在合适情况下还是选最常用的第一个吧。

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# 可视化物种注释
qiime metadata tabulate \
  --m-input-file taxonomy.qza \
  --o-visualization taxonomy.qzv
  
# 堆叠柱状图展示
qiime taxa barplot \
  --i-table table.qza \
  --i-taxonomy taxonomy.qza \
  --m-metadata-file metadata.txt \
  --o-visualization taxa-bar-plots.qzv

训练分类器

注意，这个步骤一般需要较大内存（看数据库，UNITE这个我消耗了100G左右内存），运行时间也比较久，10多个小时

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qiime feature-classifier fit-classifier-naive-bayes \
  --i-reference-reads unite-ver9-seqs_99_25.07.2023.qza \
  --i-reference-taxonomy unite-ver9-taxonomy_99_25.07.2023.qza \
  --o-classifier unite-ver9-99-classifier-25.07.2023.qza

所以尽可能可以去找别人训练好的结果（因为序列是一样的，拿来用就行，但是要注意是在跟你同版本的Qiime2环境下训练的，不然可能用不了）

这里整理了一些下载路径，可以尝试用用，毕竟不一定每个人都有足够的内存和时间来跑这个分类器：

UNITE (ITS)：https://github.com/colinbrislawn/unite-train/releases
Greengenes (16S rRNA)：http://ftp.microbio.me/greengenes_release/2022.10/sklearn-1.4.2-compatible-nb-classifiers/
Silva (16S/18S rRNA): https://anw-sh.github.io/silva-138_classifiers/
RDP (16S/28S rRNA): https://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/

Kraken物种注释

Qiime2注释可真慢呀😂，赶紧找了Kraken的替代方法，见使用Kraken进行16S/ITS物种注释（超快）

Export data

qza，qzv文件是Qiime2的标准格式，还是导出成普通的文本文件（表格等）用来后续别的平台分析吧：

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# 导出feature丰度表
qiime tools export \
  --input-path feature-table.qza \
  --output-path exported-feature-table
# 导出序列，在rep-seqs文件夹下
qiime tools export \
  --input-path rep-seqs.qza \
  --output-path rep-seqs
# 导出系统发育树
qiime tools export \
  --input-path unrooted-tree.qza \
  --output-path exported-tree

功能预测

16S测序的一大缺点就是只能的到物种信息，缺乏功能信息，使用PICRUSt软件进行16S功能预测分析（预测，稍微弥补这一缺点）。 2018年推出了全新版本的PICRUSt，即PICRUSt2https://github.com/picrust/picrust2。

PICRUSt2 (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)是一款基于标记基因序列来预测功能丰度的软件。

“功能”通常指的是基因家族，如KEGG同源基因，预测通常基于16S rRNA基因测序数据，但也可以使用其他标记基因。

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# 选择1. 使用 bioconda 安装 PICRUSt2 环境
conda create -n picrust2 -c bioconda -c conda-forge picrust2

#input就是我们上面导出来的otu.fasta和otu_table.txt
picrust2_pipeline.py -s otu.fasta -i otu_table.txt -o picrust2_result -p 4

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# 选择2. 安装q2 picrust2插件（前面提到qiime2的一个特点是插件化，这里刚好可以试试，注意安装对于Qiime2版本的）
conda install q2-picrust2 \
  -c conda-forge \
  -c bioconda \
  -c picrust 

# 跑整个流程
qiime picrust2 full-pipeline \
   --i-table feature-table.qza \
   --i-seq rep-seqs.qza \
   --output-dir q2-picrust2_output \
   --p-placement-tool sepp \
   --p-threads 1 \
   --p-hsp-method pic \
   --p-max-nsti 2 \
   --verbose

q2-picrust2_output 中的这些输出文件是：

ec_metagenome.qza - EC 宏基因组预测（行是 EC 编号，列是样本）。
ko_metagenome.qza - KO 宏基因组预测（行是 KO，列是样本）。
Pathway_abundance.qza - MetaCyc 途径丰度预测（行是Pathway，列是样本）。

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# 导出功能丰度表
qiime tools export \
   --input-path q2-picrust2_output/pathway_abundance.qza \
   --output-path pathabun_exported

这样，整个扩增子上游就差不多了，得到了feature丰度表，feature的物种注释信息，预测的功能丰度表，后续分析就类似宏基因组的部分操作了。

References

https://docs.qiime2.org/2024.10/
https://www.jianshu.com/p/f31581bbfb80
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