Panaroo：微生物泛基因组分析工具

Introduction

Panaroo是一个用于微生物泛基因组分析的高效工具，专门设计用于处理来自不同菌株的基因组注释数据。该工具通过图论方法整合和校正基因注释，能够有效识别和纠正注释错误、检测结构变异，并重构准确的泛基因组。Panaroo支持多种输入格式（GFF3、GenBank等），提供严格、中等和敏感三种运行模式，适应不同质量数据的需求。主要功能包括基因聚类、缺失基因重发现、并行处理、核心基因组对齐等。与传统工具相比，Panaroo在保持高精度的同时，显著提高了对注释错误的鲁棒性，特别适用于大规模微生物基因组比较研究。

文章介绍

研究背景与问题陈述

微生物基因组学研究经常涉及多个菌株的比较分析，传统的泛基因组分析工具（如Roary）在处理大规模数据集时面临诸多挑战。注释软件（如Prokka）在不同基因组中可能对相同基因序列产生不一致的注释，导致基因聚类错误。此外，基因组组装碎片化、测序错误和污染等问题进一步增加了分析的复杂性。Panaroo的开发旨在解决这些挑战，通过创新的图论算法提供更准确的泛基因组表征。

研究方法与技术路线

Panaroo采用多阶段处理流程，核心算法包括：

初始基因聚类：使用CD-HIT进行保守聚类，默认参数为98%序列相似性和98%长度差异阈值
图构建：将基因聚类表示为图结构，节点代表基因家族，边代表基因组中的相邻关系
图校正：通过多种启发式方法识别和校正注释错误，包括：
- 末端基因修剪：移除低支持度的末端簇
- 边缘过滤：基于支持度阈值清理可疑连接
- 长度异常值检测：处理长度异常的基因注释
基因重发现：在注释缺失的基因组区域搜索可能存在的基因
并行化处理：支持多线程加速，提高大规模数据集处理效率

主要发现与创新点

Panaroo的主要创新体现在以下几个方面：

智能错误校正：通过图论方法系统识别和校正多种类型的注释错误，显著提高聚类准确性
灵活的运行模式：提供strict、moderate、sensitive三种模式，适应不同数据质量需求
基因重发现功能：能够检测和恢复被注释工具遗漏的基因，提高基因检测灵敏度
结构变异分析：内置结构变异检测功能，可直接从泛基因组图中识别基因组重排事件
可视化支持：生成兼容Cytoscape的图文件，便于结果可视化和解释

研究意义与贡献

Panaroo为微生物比较基因组学研究提供了更可靠的分析工具，特别是在处理大规模、多样化数据集时表现出色。其准确的基因聚类和错误校正能力有助于发现真实的基因含量差异，为病原菌进化研究、功能基因组学和疫苗设计等领域提供更可靠的数据基础。工具的开源特性也促进了方法的透明性和可重复性。

使用教程

安装部署

环境要求

Python 3.9或更高版本（Bioconda目前推荐使用3.9）
至少4GB内存（大型数据集需要更多）
足够的磁盘空间存储中间文件和结果

依赖安装

Conda安装（推荐）

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# 创建并激活环境
conda create -n panaroo python=3.9
conda activate panaroo

# 使用conda安装
conda install -c conda-forge -c bioconda -c defaults 'panaroo>=1.3'

# 或使用mamba加速安装
conda install mamba -c conda-forge
mamba install -c conda-forge -c bioconda -c defaults 'panaroo>=1.3'

手动安装

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# 安装系统依赖
sudo apt-get install cd-hit mafft  # Ubuntu/Debian系统

# 安装Python包
pip3 install git+https://github.com/gtonkinhill/panaroo

# 或从源码安装
git clone https://github.com/gtonkinhill/panaroo
cd panaroo
python3 setup.py install

可选依赖

Prokka：用于基因组注释
PRANK/Clustal：替代MAFFT进行多序列比对
MASH：用于质量控制和参考数据库比较

基本使用方法

快速开始

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# 创建结果目录
mkdir results

# 基本运行命令（使用Prokka生成的GFF文件）
panaroo -i *.gff -o results --clean-mode strict

处理RefSeq格式文件

RefSeq注释文件可能包含不符合预期的注释，如包含提前终止密码子的基因：

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panaroo -i *.gff -o results --clean-mode strict --remove-invalid-genes

运行模式选择

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# 严格模式（默认）- 去除可能的污染，保留大多数感兴趣基因
panaroo -i *.gff -o results --clean-mode strict

# 敏感模式 - 保留稀有质粒，可能包含更多假阳性
panaroo -i *.gff -o results --clean-mode sensitive

输入格式支持

Panaroo支持多种输入格式：

标准GFF3文件
包含文件路径列表的文本文件
分隔的GFF和FASTA文件
GenBank格式文件（.gbk, .gb, .gbff）

进阶应用

多序列比对生成

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# 对核心基因（≥98%菌株中存在）进行比对，使用Clustal，10线程
panaroo -i *.gff -o ./results/ --clean-mode strict -a core --aligner clustal --core_threshold 0.98 -t 10

# 生成所有基因簇的比对
panaroo -i *.gff -o ./results/ --clean-mode strict -a pan --aligner mafft -t 8

基因家族聚类参数调整

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# 使用更宽松的家族聚类阈值（50%相似性）
panaroo -i *.gff -o ./results/ --clean-mode strict -f 0.5

处理旁系同源基因

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# 默认情况下分离旁系同源基因，可选项合并它们
panaroo -i *.gff -o ./results/ --clean-mode strict --merge_paralogs

基因重发现参数优化

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# 在1000nt半径内搜索，要求至少50%序列匹配
panaroo -i *.gff -o ./results/ --clean-mode strict --refind_prop_match 0.5 --search_radius 1000

# 关闭基因重发现功能
panaroo -i *.gff -o ./results/ --clean-mode strict --refind-mode off

数据预处理和质量控制

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# 使用panaroo-qc进行质量检查
panaroo-qc -t 3 --graph_type all -i *.gff --ref_db refseq.genomes.k21s1000.msh -o results

参考 mash 数据库可以从 https://mash.readthedocs.io/en/latest/tutorials.html 下载

一致性注释生成

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# 使用Prodigal创建训练文件
prodigal -t prodigal_training_file -c -m -g 11 -p single -q -i input_file.fasta > /dev/null

# 使用训练文件运行Prokka
prokka --prodigaltf prodigal_training_file input_file.fasta

参数详解

核心参数说明

--clean-mode：运行模式，影响错误校正的严格程度
--threshold：初始聚类序列相似性阈值（默认0.98）
--family_threshold：基因家族聚类阈值（默认0.7）
--core_threshold：核心基因组定义阈值（默认0.95）

不同模式的默认参数

参数	严格模式	中等模式	敏感模式
min_trailing_support	max(2, ⌈0.05N⌉)	max(2, ⌈0.01N⌉)	2
trailing_recursive	∞	∞	1
remove_by_consensus	True	False	False

常见问题与解决方案

安装问题

问题1：Python版本兼容性错误

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# 解决方案：创建指定版本的环境
conda create -n panaroo python=3.9

问题2：依赖包冲突

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# 解决方案：使用干净的conda环境
conda create -n panaroo --no-default-packages python=3.9

运行错误

问题1：无效基因注释错误

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# 解决方案：启用无效基因过滤
panaroo -i *.gff -o results --remove-invalid-genes

问题2：内存不足

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# 解决方案：减少线程数，使用更严格过滤
panaroo -i *.gff -o results --clean-mode strict -t 2

性能优化

大型数据集（>100基因组）建议使用8-16线程
敏感模式需要更多内存和计算时间
预处理阶段使用panaroo-qc识别潜在问题

输出文件详解

主要输出文件

gene_presence_absence.csv

基因存在/不存在矩阵，格式与Roary兼容。包含每个基因簇在各样本中的存在情况，合并的注释用分号分隔，含终止密码子的基因添加"_stop"后缀，长度异常基因添加"_len"后缀。

gene_presence_absence.Rtab

二进制版本的基因存在/不存在矩阵，便于统计分析。

final_graph.gml

最终泛基因组图，可使用Cytoscape可视化或NetworkX进行进一步分析。包含基因注释和基因组特异性信息。

struct_presence_absence.csv

基因组重排事件的存在/不存在矩阵，可通过--min_edge_support_sv参数调整检测阈值。

pan_genome_reference.fa

线性参考基因组，包含数据集中所有基因。注意：旁系同源基因簇仅出现一次以避免多映射问题。

序列文件

combined_DNA_CDS.fasta

包含所有注释和重发现基因的核苷酸序列，使用Panaroo内部命名，可通过gene_data.csv文件转换为原始名称。

combined_protein_CDS.fasta

与上述文件对应的蛋白质序列。

比对文件

core_gene_alignment.aln

核心基因多序列比对文件，包含至少达到--core_threshold阈值菌株中存在的基因。

core_gene_alignment_filtered.aln

过滤后的核心基因组比对，推荐用于构建系统发育树。使用BMGE过滤异常基因，默认基于Tukey异常值检测自动调整。

References

Tonkin-Hill, G., MacAlasdair, N., Ruis, C., Weimann, A., Horesh, G., Lees, J.A., Gladstone, R.A., Lo, S., Beaudoin, C., Floto, R.A., et al. (2020). Producing polished prokaryotic pangenomes with the panaroo pipeline. Genome Biol. 21, 180. https://doi.org/10.1186/s13059-020-02090-4.
https://gthlab.au/panaroo/